BCA法测蛋白浓度怎么计算?

新闻资讯 (42) 6个月前

分光光度法介绍

分光光度法是利用溶液中,特定溶质的光吸收测定其浓度的方法, 其基本原理是根据 Lambert和 Beer 定律。

一、Lambert 定律

当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时, 溶液将吸收一部分光能, 使光的强度减弱。若溶液的浓度不变,则在溶液中的光程越长,光线强度的减弱也越显著。设:入射光强度为 I 0 ,透射光强度为 I,L 代表光在溶液中的光程。lgI0I =K 1 L K 1 是常数,受光线波长,溶液性质bca法测蛋白浓度原理,溶液浓度影响。

二、Beer 定律

当一束光通过一溶液时, 光能被溶液介质吸收一部分,若光程不变bca法测蛋白浓度原理,则溶液的浓度越大,光吸收越强,透射光强度的减弱也越显著,光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。lgI0I =K 2 C K 2 为吸收系数,是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度 C 成正比。

三、Lambert-Beer 定律

将以上两个定律合并:lgIoI =KCL 令 A=lgIoIT= IIo则 A=KCL=-lgTT为透光度, A 为吸光度, K 为消光系数

四、待测样品浓度的计算

A 标 =KC 标 L A 样 =KC 样 L由于是同一物质及相同的光程,则:A样 /A 标 =KC 样 L/KC 标 L=C 样 /C 标 即: C 样 =(A 样 /A 标 )*C 样故已知标准溶液的浓度及吸光度bca法测蛋白浓度原理,依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。

一 实验名称:

BCA 法测定蛋白质含量

二 实验原理:

BCA 即二奎碄甲酸。在碱性条件下,蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子,亚铜离子与 BCA 试剂形成稳定的紫色络合物, 并在 562nm 处有最大的光吸收值, 该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比,故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。

三 实验步骤:

A 标准品的稀释:将 9 支干燥的 1.5ml 离心管编号,按表加入下列试剂:BCA法标准曲线和样品测定1.2ml 离心管ddH 2 O(μL)2mg/mLBSA (μL)蛋白质终浓度( μg/mL) A 0 50μL标准品 2000 B 125 375μL标准品 1500 C 325 325μL标准品 1000 D 175 175μLB管混合液 750 E 325 325μLC管混合液 500 F 325 325μLE管混合液 250 G 325 325μLF管混合液 125 H 400 100μLG管混合液 25 I 400 0 0=Blank B 配置 BCA 工作液:依据样品数量,将试剂 A 和试剂 B 按体积比 50:1 配制适量 BCA 工作液,并充分混匀。

C 标准品及样品的测定:

1)分别取 25μL 上表中新鲜配制的 BSA 标准液和待测样品,加入到微孔板中;

2)每孔中加入 200μLBCA 工作液,并充分混匀;

3)加盖, 37℃孵育 30min 后冷却至室温或室温放置 2h;

4)以 I 号管调零点,于 562nm 处测定各管吸光度

5)以吸光度为纵坐标,蛋白质含量为横坐标,绘制标准曲线。

计算样品的蛋白浓度。

四 实验结果:

实验数据如下:

(加粗数据是样品吸光度)A STANDARD C

1.831 1.951 2000 1.337 1.457 1500 1.031 1.251 1000 750 0.611 0.755 500 0.329 0.449 250 0.162 0.282 125 0.049 0.169 25 0 0.12 0 0.603 0.723 y = 0.0009x + 0.0688R2 = 0.991200.511.520 500 1 2500系列1线性 ( 系列1)将样品数据代入方程:得出: x=726.89 μg/mL,即样品中的蛋白质浓度为 726.89 μ g/mL五 讨论:1 从标准曲线中可以看出,溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关,蛋白质含量越高,吸光度就越高。

2 配制溶液时一定要细心,不要配错,正确使用移液枪,及时换枪头,避免污染;

3 当离心管中已经注入溶液,小心不要因为过失而导致其漏液,造成损失;

4 测定吸光度时注意调整波长;

5 该方法快速,灵敏度高,试剂稳定性好,对不同种类蛋白质的检测的变异系数小,而且BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响,低浓度的去垢剂不影响检验结果,在微孔板中进行测定,可以大大节约样品和试剂用量。

6 此种方法的测定范围是 20~2000 μg/mL

一、实验名称:

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量:

二、实验原理:

考马斯亮蓝在酸性条件下和蛋白质结合,使染料最大吸收值从 465nm 变为 595nm,在一定的线性范围内,反应液 595nm 处吸光度的变化量与反应蛋白成正比,测定 595nm 处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定范围为 50μ g-1000μg/ml

三、实验步骤:

A 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和的颠倒混匀;B 标准品的稀释:将 7 支干燥试管编号,按表加入下列试剂:考马斯亮蓝法标准曲线和样品测定试剂 0 1 2 3 4 5 6 BSA液(μl )2mg/ml 0 5 10 20 30 60 0 PBS(μl) 150 145 140 130 120 90 150 蛋白质终含量( mg/mL) 0 0.067 0.13 0.27 0.4 0.8 0 C 标准品及样品的测定

1)将 5μL 体积的样品加入到试管中,并用 PBS 补足到 150μ L;

2)向各个试管中加入 2.85mL 考马斯亮蓝染液,混匀,室温放置 5-10min;

3)以 0号管调零点,于 595nm 处测定各管吸光度;

4)以吸光度为纵坐标,蛋白质含量为横坐标,绘制标准曲线。

计算样品的蛋白浓度。

四、实验结果:

标准曲线:y = 1.0698x + 0.1321R2 = 0.980300.20.40.60.811.20 0.5 1系列1线性 ( 系列1)样品对应的吸光度为 1.148将样品数据代入方程:得出: x=949.6 μg/mL,即样品中的蛋白质浓度为 0.9496mg /mL

五、讨论

1 考马斯亮蓝可以和石英比色皿产生强烈的结合,建议使用玻璃或塑料比色皿;

2 不同的蛋白可以和 CBBG的结合程度不同,因此使用被测蛋白作标准曲线,可以得到更准确的结果;

3 应按蛋白浓度从低到高的顺序进行测定, 测定过程请连续进行, 不要清洗比色皿, 因为水质会影响测定结果;

4 测定吸光度时注意调整波长;

5 从标准曲线中可以看出,溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关,蛋白质含量越高,吸光度就越高;

6 此种方法的测定范围是 50~1000 μg/mL;

7 使用分光光度计时,每一次打开盖子后,都需要再次矫正,不然会产生误差;

8 在使用可见光分光光度计时, 注意往装液体时不可过多, 以防洒出损伤仪器。 也不能过少,可能导致无法测量液体的分光度;

9 由考马斯亮蓝法测得的蛋白质浓度和用 BCA法测得的蛋白质浓度有很大差距, 原因我们分析有以下几点:

1 )我们可能在操作的过程中没有注意细节,比如试管中残留的蒸馏水没有完全除去,或者比色皿中的残留液体没有完全擦干, 或者试液加入的量错误等等, 这些错误是由我们实验者自身造成的,所以说这次试验并不是很成功,我们实验者要有一部分责任;

2 )仪器本身的误差也是客观存在的,比如移液枪的个体差异,有一些会因为枪或者枪头的原因使液体量多或者量少;分光仪器本身的误差等等。

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